種子作為農業生產的“芯片”，其純度直接決定作物群體的一致性、抗逆性及最終產量。據《中華人民共和國種子法》規定，主要農作物種子純度需達到96%以上（常規種）或98%以上（雜交種），但生產中因機械混雜、生物學混雜等問題，雜質種子混入常導致純度不達標，每年給我國農業造成數十億元經濟損失。因此，建立高效、精準的種子純度鑒定技術，是保障種業安全與農業高質量發展的核心需求。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、種子樣品

水稻品種“南粳46”（純合樣品，純度99.9%）及雜質種子（“南粳5055”）；

玉米品種“鄭單958”（純合樣品，純度99.9%）及雜質種子（“先玉335”）；

2、主要儀器

熒光定量PCR儀；納米滴分光光度計；高速離心機；超凈工作臺。

（二）實驗方法

1、種子基因組DNA提取

取單粒種子，去殼后研磨成粉末，稱取10mg粉末加入200μL裂解液（試劑盒配套），65℃水浴30min；

加入200μL氯仿，渦旋混勻后12000rpm離心10min，取上清液；

按試劑盒說明書加入吸附柱、洗滌液，最終用50μL洗脫液洗脫DNA；

用納米滴分光光度計檢測DNA純度，1%瓊脂糖電泳驗證DNA完整性。

2、特異性驗證

分別以“南粳46”、“南粳5055”、“鄭單958”、“先玉335”的基因組DNA為模板，采用優化的qPCR體系進行擴增，通過熔解曲線（單一峰為特異性擴增）和熒光信號值（非目標品種無熒光信號）驗證引物探針的特異性。

3、標準曲線構建與靈敏度分析

制備“南粳46”雜質梯度樣品：將“南粳5055”（雜質）與“南粳46”（純合）種子按質量比混合，制備雜質含量為0.1%、0.5%、1%、5%、10%的樣品，每個梯度3次重復；

提取各梯度樣品的混合DNA（每個樣品提取3次，取平均值）；

以各梯度DNA為模板進行qPCR擴增，記錄Ct值，以雜質含量的對數（lgC）為橫坐標，Ct值為縱坐標，構建標準曲線，計算擴增效率；

4、實際樣品純度檢測與準確性驗證

隨機選取3批“南粳46”商品種子和3批“鄭單958”商品種子；

每批樣品隨機取100粒種子，提取混合DNA，采用熒光定量PCR儀進行qPCR檢測，根據標準曲線計算純度；

同時采用傳統SSR-PCR電泳法進行純度檢測，以電泳法結果為對照，計算qPCR檢測結果的相對偏差。

5、穩定性與重復性驗證

批內重復性：選取“南粳46”1% 雜質樣品，在同一批次實驗中進行8次平行qPCR擴增，計算Ct值的變異系數；

批間重復性：同一“南粳46”1% 雜質樣品，在3個不同日期（間隔7d）進行qPCR擴增，每次3次重復，計算總CV值。

二、結果與分析

（一）DNA提取質量

所有種子樣品的DNA提取結果顯示，OD???/OD???均在1.82-1.95之間，瓊脂糖電泳呈現單一明亮條帶（無彌散），表明DNA純度與完整性符合qPCR實驗要求，無抑制劑殘留影響擴增效率。

（二）特異性驗證結果

熔解曲線分析顯示，僅“南粳46”模板在60℃左右出現單一特異性峰，“南粳5055”、“鄭單958”、“先玉335”模板均無明顯熒光峰（熒光信號值<100）；熒光信號圖顯示，非目標品種的Ct值均大于38（視為陰性），證明引物探針特異性良好，無交叉反應，可準確區分目標品種與雜質品種。

（三）標準曲線與靈敏度

以“南粳46”雜質梯度樣品構建的標準曲線，其線性回歸方程為Ct=-3.42lgC+35.68，相關系數R2=0.998，擴增效率E=96.5%（符合90%-110%標準）。靈敏度分析顯示，雜質含量為0.1%的樣品仍可穩定檢出（Ct=34.2±0.5），且3次重復的CV=1.4%，表明熒光定量PCR儀的最低檢測限可達0.1%，顯著優于傳統PCR-電泳法（檢測限>1%）。

（四）實際樣品檢測準確性

6批商品種子的純度檢測結果。博清生物熒光定量PCR儀檢測結果與傳統SSR電泳法結果的相對偏差均小于5%（范圍1.2%-4.8%），且檢測周期由電泳法的2-3d縮短至4-6h，顯著提升了檢測效率。

（五）穩定性與重復性

批內重復性實驗中，8次平行擴增的Ct值為28.6±0.4，CV=1.4%；批間重復性實驗中，3個批次的Ct值分別為28.5±0.3、28.7±0.5、28.4±0.4，總 CV=0.9%。兩者CV值均小于3%，表明博清生物熒光定量PCR儀的檢測穩定性良好，重復性優異，可滿足批量樣品的標準化檢測需求。

三、討論

（一）博清熒光定量PCR儀在種子純度鑒定中的核心優勢

本研究證實，博清生物熒光定量PCR儀在農業種子純度鑒定中具有三大核心優勢：

1、高精準性：基于特異性SSR探針與多通道檢測，可有效區分近緣品種（如水稻“南粳46”與“南粳5055”），檢測限低至0.1%，可捕獲極低比例的雜質種子，避免傳統方法的漏檢問題；

2、高效性：優化的反應體系與儀器快速溫控模塊（升降溫速率6℃/s），使檢測周期縮短至4-6h，可滿足種子企業“隨到隨檢”的質量控制需求，尤其適用于播種季前的緊急抽檢；

3、易用性：儀器配套的智能化分析軟件可自動生成標準曲線、計算純度結果，并支持數據導出與溯源，降低了對操作人員的技術要求，便于基層檢測機構推廣應用。

（二）與其他技術的對比與應用場景拓展

相較于現有技術，熒光定量PCR儀應用場景更廣泛：

1、對比形態學鑒定：無需等待種子萌發，可直接對干種子進行檢測，不受生長周期限制；

2、對比普通PCR-電泳：無需凝膠制備與染色，減少人為操作誤差，且可定量分析，而非僅定性判斷；

3、未來拓展：可通過設計多品種特異性探針，實現同一反應體系中對多種作物種子的同時檢測（如水稻與玉米混合樣品），進一步提升檢測效率。

（三）研究局限性與未來方向

本研究僅驗證了博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀在水稻、玉米中的應用，對于棉花、大豆等其他作物，需進一步優化引物探針設計與反應體系；此外，針對未知品種的雜質鑒定，需結合高通量測序技術構建更全面的標記數據庫。未來可聯合博清生物開發“儀器-試劑-試劑盒”一體化的種子純度檢測解決方案，推動技術的產業化落地。

本研究以博清生物科技（南京）有限公司熒光定量PCR儀為核心，建立了基于SSR標記的種子純度鑒定技術體系。結果表明，該儀器在水稻、玉米種子純度檢測中具有特異性強、靈敏度高（檢測限0.1%）、準確性好（相對偏差<5%）、穩定性優（CV<3%）及效率高（4-6h完成檢測）的特點，可有效解決傳統鑒定方法耗時、低效、準確性低的問題。

博清生物熒光定量PCR儀為農業種子純度鑒定提供了可靠的技術工具，可廣泛應用于種子生產企業質量控制、農業行政監管及生物技術育種科研領域，對保障種業安全、推動農業生物技術產業化具有重要意義。