核酸提取是水體微生物分子分析的第一步，其質量直接影響后續實驗結果的可靠性。傳統核酸提取方法（如酚氯仿法、離心柱法）存在操作繁瑣、耗時較長（單次提取需2-3小時）、人為誤差大等問題，且易因水體中腐殖酸、重金屬等抑制劑殘留，導致核酸純度低、后續PCR擴增抑制。尤其針對低生物量水體（如寡營養湖泊）或高污染水體（如工業廢水），傳統方法往往難以兼顧提取效率與核酸質量，限制了微生物分析的精準性。

博清生物科技（南京）有限公司研發的核酸提取儀基于磁珠法原理，集成樣品裂解、核酸結合、洗滌、洗脫全流程自動化，可實現16個樣品同時處理，單次提取時間縮短至30分鐘以內。該儀器通過優化裂解緩沖液配方與磁珠吸附條件，可減少抑制劑殘留、提高核酸回收率。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、水樣采集

每類水體設置 3 個重復采樣點：

河流樣品（R）：采集某市城區河流表層水；

湖泊樣品（L）：采集城郊淡水湖泊表層水；

近海樣品（M）：采集近海口表層水。

所有水樣采集后立即置于4℃保溫箱中，24小時內完成預處理。

2、主要試劑與儀器

儀器：博清生物核酸提取儀；超微量分光光度計；熒光定量PCR儀；高通量測序儀；電泳儀。

試劑：博清生物磁珠法水體微生物核酸提取試劑盒；傳統酚氯仿提取試劑；基因高通量測序試劑盒；基因qPCR試劑盒；瓊脂糖。

（二）實驗方法

1、水樣預處理

取100mL水樣，通過0.22μm聚碳酸酯濾膜真空抽濾富集微生物；將濾膜剪碎后轉入50mL 離心管，加入10mL無菌PBS緩沖液，渦旋振蕩10分鐘，4℃、8000rpm 離心10分鐘，收集菌體沉淀，用于后續核酸提取。

2、核酸提取

設置兩組提取方法，每組3次重復：

博清儀器組：按照核酸提取儀操作說明書，取菌體沉淀加入500μL裂解液，渦旋混勻后轉入儀器專用反應板；設置提取程序：裂解溫度56℃、時間10分鐘，磁珠結合時間5分鐘，洗滌次數3次，洗脫溫度70℃、時間5分鐘；最終洗脫體積為50μL，收集核酸溶液。

傳統方法組：采用酚氯仿法：菌體沉淀中加入500μL裂解液（含1% SDS、10mmol/L EDTA），65℃水浴30分鐘；加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），渦旋2分鐘，4℃、12000rpm 離心10分鐘；取上清液，重復酚氯仿抽提1次；加入0.8倍體積異丙醇，-20℃沉淀30分鐘；4℃、12000rpm離心15分鐘，沉淀用75%乙醇洗滌2次，晾干后用50μL無菌水溶解，即得核酸溶液。

3、核酸質量檢測

濃度與純度：使用超微量分光光度計檢測核酸濃度（ng/μL）及A260/A280、A260/A230 比值。

完整性：采用1%瓊脂糖凝膠電泳（120V、30分鐘），EB染色后通過凝膠成像系統觀察核酸條帶，判斷是否存在降解（完整核酸條帶為清晰單一亮帶，無彌散）。

4、水體微生物分析

高通量測序：以提取的核酸為模板，擴增16S rRNA基因V4-V5區；PCR產物純化后構建Illumina文庫，通過MiSeq平臺測序；使用QIIME2軟件進行數據分析，統計 OTU（操作分類單元）數量、Shannon多樣性指數、Simpson優勢度指數，并進行物種注釋。

qPCR檢測：以氨氧化細菌amoA基因為目標；反應體系（20 μL）：SYBR Premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.8μL，模板核酸2μL，無菌水6.4μL；反應程序：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，40個循環；記錄Ct值，計算擴增效率。

5、數據分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，兩組間差異采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異顯著；使用R4.2.0軟件繪制物種相對豐度熱圖及多樣性指數箱線圖。

二、結果與分析

（一）核酸提取質量對比

1、濃度與純度

不同水體樣品中，博清儀器組的核酸提取濃度均顯著高于傳統方法組：河流樣品中，博清組濃度為62.1±3.5ng/μL，傳統組為35.8±2.9ng/μL；湖泊樣品中，博清組為55.3±4.1 ng/μL，傳統組為30.2±3.2ng/μL；近海樣品中，博清組為57.2±3.8ng/μL，傳統組為31.5±2.7ng/μL。

純度方面，博清儀器組的A260/A280比值穩定在1.85-1.95，符合純DNA標準；而傳統方法組因蛋白殘留，A260/A280比值普遍為1.55-1.68，低于標準范圍。A260/A230比值中，博清組均>2.0（2.05-2.18），表明抑制劑殘留少；傳統組則為1.2-1.5，提示存在腐殖酸或鹽類殘留。

2、核酸完整性

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，博清儀器組提取的核酸條帶清晰單一，無明顯彌散，表明核酸完整性好，無降解；而傳統方法組的核酸條帶存在不同程度的彌散現象，尤其河流樣品（高污染）的彌散更明顯，提示核酸降解嚴重，可能與傳統方法操作步驟多、暴露時間長有關。

（二）高通量測序結果對比

1、群落豐富度與多樣性

博清儀器組的OTU數量顯著高于傳統方法組：河流樣品中，博清組OTU為1923±85，傳統組為1286±68；湖泊樣品中，博清組為1815±76，傳統組為1192±59；近海樣品中，博清組為1740±92，傳統組為1167±71。

多樣性指數方面，博清儀器組的Shannon指數（反映群落多樣性）顯著高于傳統方法組（P<0.05），而Simpson指數（反映群落優勢度）顯著低于傳統方法組（P<0.05），表明博清儀器提取的核酸能更全面地反映水體微生物的群落多樣性，減少低豐度物種的遺漏。

2、物種組成與注釋

物種注釋結果顯示，博清儀器組的物種注釋率（98.2%-99.1%）高于傳統方法組（92.5%-94.3%）。在門水平上，兩組均以變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門為主，但博清組能檢出傳統方法組遺漏的低豐度門；在屬水平上，博清組檢出的潛在功能屬豐度更接近實際水體情況，而傳統方法組因抑制劑殘留，部分功能屬的豐度被低估。

（三）qPCR檢測結果對比

以amoA基因為目標的qPCR結果顯示，博清儀器組的Ct值顯著低于傳統方法組（P<0.05），擴增效率顯著高于傳統方法組（P<0.05）：河流樣品中，博清組Ct值為23.8±0.4，擴增效率98.5%；傳統組Ct值為28.2±0.7，擴增效率83.1%。這表明博清儀器提取的核酸中抑制劑殘留少，模板質量高，更適合后續定量分析。

三、討論

本研究通過對比實驗驗證了博清生物核酸提取儀在水體微生物分析中的優勢，其核心性能提升可歸因于以下三點：

（一）自動化磁珠法的高效性：傳統酚氯仿法依賴人工操作，步驟繁瑣且易因離心、移液誤差導致核酸損失；而博清儀器采用磁珠法，通過自動化控制裂解溫度、結合時間等參數，實現核酸的高效吸附與洗脫，顯著提升提取濃度（平均提升79%），且單次提取時間縮短至30分鐘，滿足環境監測中“快速批量分析”的需求（如突發水污染事件的應急檢測）。

（二）抑制劑殘留的有效控制：水體中的腐殖酸、重金屬等抑制劑是影響核酸質量的關鍵因素——傳統方法僅通過酚氯仿抽提去除雜質，效果有限；而博清儀器配套試劑盒中的洗滌緩沖液可特異性結合抑制劑，通過多次自動化洗滌（3次）顯著降低殘留，表現為A260/A230比值>2.0，進而減少對后續PCR的抑制。

（三）微生物群落的精準表征：低豐度微生物（如功能型氨氧化細菌）往往是水體生態過程的關鍵驅動者，但傳統方法因提取效率低易導致其漏檢；博清儀器通過高回收率（核酸濃度提升）和低抑制劑殘留，顯著提高OTU數量（平均提升50%）及低豐度物種檢出率，使群落多樣性指數更接近實際水體情況，為生態研究中“微生物功能-環境因子關聯分析”提供可靠數據基礎。

在環境監測應用中，博清儀器的優勢可具體體現為：針對高污染水體，其可快速提取高質量核酸，通過qPCR檢測致病菌或功能基因，實現水質污染程度的快速評估；針對寡營養水體，其高靈敏度可檢出低豐度微生物，為早期生態退化的預警提供依據。在生態研究中，該儀器可支撐長期動態監測，通過批量處理樣品減少人為誤差，提升數據的可比性。

博清生物科技（南京）有限公司研發的核酸提取儀在水體微生物核酸提取中表現出高濃度、高純度、高自動化的優勢，其提取的核酸可滿足高通量測序、qPCR等后續分子生物學分析的要求，顯著提升水體微生物群落表征的精準性。該儀器可有效解決傳統方法操作繁瑣、抑制劑殘留多、低豐度物種漏檢等問題，為環境監測中的水質快速評價及生態研究中的微生物功能解析提供高效、可靠的技術支撐，具有廣泛的應用前景。