細菌性感染是臨床常見的感染類型，其病原體（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等）可引發肺炎、泌尿系統感染、敗血癥等多種疾病，嚴重時危及生命。及時、準確的病原體檢測是指導臨床合理用藥、降低并發癥發生率的關鍵。目前，臨床常用的細菌檢測方法以傳統培養法為主，但該方法存在檢測周期長（24~48h）、靈敏度有限等缺陷，難以滿足急性細菌性感染的快速診斷需求。

酶標儀作為酶聯免疫技術的核心檢測設備，憑借其自動化程度高、檢測速度快、結果可量化等特點，已廣泛應用于病原體檢測領域。博清生物科技（南京）有限公司研發的酶標儀是針對免疫檢測優化設計的設備，具備雙波長檢測、多通道同步讀取、數據自動分析等功能，理論上可提升病原體檢測的效率與準確性。本研究通過建立基于該儀器的ELISA檢測體系，系統評估其在細菌性感染病原體檢測中的性能，為其科研轉化與臨床應用提供實驗依據。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、菌株來源：本研究選取6種臨床常見致病菌（金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、奇異變形桿菌ATCC 12453、表皮葡萄球菌ATCC 12228、糞腸球菌ATCC 29212）及3種非目標菌株（白色念珠菌ATCC 10231、銅綠假單胞菌ATCC 27853、鮑曼不動桿菌ATCC 19606），均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。

2、試劑：致病菌特異性單克隆抗體（抗金黃色葡萄球菌α-溶血素抗體、抗大腸桿菌O157抗原抗體等）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG二抗、3,3&,5,5&- 四甲基聯苯胺（TMB）底物液、封閉液（5%脫脂奶粉）；LB培養基、PBS緩沖液（pH7.4）由實驗室自行配制。

3、儀器：博清生物酶標儀、恒溫培養箱、高速離心機、超凈工作臺。

（二）實驗方法

1、菌株培養與樣本制備

將各致病菌接種于LB培養基，37℃恒溫培養12h后，用PBS緩沖液調整菌液濃度至10? CFU/mL，再通過梯度稀釋得到10?、10?、103、102、101CFU/mL的系列濃度菌液，作為檢測樣本；非目標菌株按相同方法培養并制備成10?CFU/mL菌液，用于特異性驗證。

2、ELISA 檢測體系建立

包被：將致病菌特異性單克隆抗體用包被緩沖液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至2μg/mL，每孔加100μL至96孔酶標板，4℃孵育12h后，用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次3min。

封閉：每孔加200μL 5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1h，PBST洗滌3次。

加樣與孵育：每孔加100μL系列濃度菌液（空白對照加 PBS），37℃孵育1.5 h，PBST洗滌3次。

加酶標二抗：將HRP標記的二抗用封閉液稀釋至1:5000，每孔加100μL，37℃孵育1h，PBST洗滌5次。

顯色與終止：每孔加100μL TMB底物液，37℃避光孵育15min，隨后加50μL 2mol/L H?SO?終止反應。

3、博清生物酶標儀檢測參數設置

采用博清酶標儀進行檢測，設置檢測波長為450 nm（TMB顯色主峰），參考波長為630nm（消除背景干擾），選擇“雙波長差值”檢測模式，自動讀取每孔吸光度值（OD???????）。以OD值≥0.2且大于空白對照OD值2倍判定為陽性。

4、性能評估實驗

重復性驗證：選取103CFU/mL的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌液各1份，每份樣本平行檢測10次（批內重復），連續檢測5d（批間重復），計算CV值（CV=標準差/平均值×100%）。

特異性驗證：檢測6種目標致病菌（10?CFU/mL）及3種非目標菌株（10?CFU/mL），記錄陽性率，評估交叉反應。

靈敏度驗證：檢測系列濃度（101~10? CFU/mL）的目標致病菌菌液，以陽性判定標準確定最低檢測限（LOD）。

檢測效率對比：分別采用博清酶標儀ELISA法與傳統培養法檢測20份模擬感染樣本（含 103CFU/mL 目標菌），記錄兩種方法的檢測周期及陽性符合率。

二、結果

（一）重復性結果

博清生物酶標儀對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的批內CV分別為2.8%、3.2%，批間CV分別為4.1%、4.5%，均小于5%，表明儀器檢測重復性良好。

（二）特異性結果

6種目標致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等）均檢測為陽性，3種非目標菌株（白色念珠菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌）均檢測為陰性，無交叉反應，特異性達100%。

（三）靈敏度結果

博清生物酶標儀對6種目標致病菌的最低檢測限均為102 CFU/mL，而傳統培養法的最低檢測限為103CFU/mL，儀器靈敏度顯著優于傳統方法。

（四）檢測效率對比

20份模擬感染樣本中，博清酶標儀ELISA法與傳統培養法的陽性符合率均為100%，但前者檢測周期僅為4~6h，后者需24~48h，檢測效率提升4~6倍。

三、討論

細菌性感染的早期診斷依賴于快速、準確的病原體檢測技術。本研究針對博清生物酶標儀的性能驗證結果表明，該儀器在細菌性感染病原體檢測中具有顯著優勢：

1、高穩定性與特異性：批內、批間CV均小于5%，符合免疫檢測的重復性要求；且對非目標菌株無交叉反應，可有效避免誤診，這得益于儀器的雙波長檢測模式——通過參考波長（630nm）消除樣本濁度、酶標板吸附差異等背景干擾，提升結果準確性。

2、高靈敏度與快速性：最低檢測限達102CFU/mL，優于傳統培養法，可檢測低濃度感染樣本，減少漏診；同時，檢測周期縮短至4~6h，解決了傳統培養法“耗時久”的痛點，有助于臨床在感染早期啟動針對性治療，降低抗生素濫用風險。

本研究仍存在局限性：樣本類型僅覆蓋純菌液與模擬感染樣本，未納入臨床真實樣本（如血液、尿液），后續需進一步驗證儀器在復雜基質中的檢測性能；此外，研究僅針對6種常見致病菌，對耐藥菌株（如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA）的檢測適用性仍需拓展。

未來可結合核酸擴增技術（如PCR）與博清酶標儀的檢測優勢，開發“核酸-免疫聯合檢測”體系，進一步提升靈敏度；同時，優化儀器的自動化流程，實現樣本加樣、孵育、檢測的一體化，適配更多臨床樣本類型，推動其在基層醫療機構的普及應用。

本研究通過重復性、特異性、靈敏度及檢測效率的系統評估，證實博清生物科技（南京）有限公司研發的酶標儀在細菌性感染病原體檢測中具有穩定、特異、靈敏、快速的核心優勢，可滿足科研階段的致病菌篩查需求，并為臨床細菌性感染的早期診斷提供可靠的技術支持，具有較高的應用價值與轉化潛力。